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純化后的蛋白質和肽的水解

更新時間:2024-12-25      點擊次數(shù):26

  蛋白質和肽"是指從生物反應器或純化過程得到的相對純凈的樣品。這些樣品幾乎或完全不含其他非蛋白質物質。讓完整蛋白質或肽生成游離氨基酸,是獲取有用且準確的氨基酸分析數(shù)據(jù)的關鍵步驟。要生成游離氨基酸,必須將蛋白質/肽分解或水解為單個氨基酸組分。

本節(jié)介紹了氣相及液相蛋白質和肽水解的基本步驟,著重介紹實現(xiàn)出色分析應考慮的基本要點。

附加的子小節(jié)介紹了其他可選的水解方法,采用這些方法可分析含標準鹽酸水解技術無法水解的氨基酸(色氨酸和半胱氨酸/胱氨酸)的特殊樣品。

2.1 蛋白質的酸水解

本節(jié)重點介紹制備氨基酸樣品十分常用的方法 - 鹽酸水解法。無論采用哪種方法,要想完全水解蛋白質樣品,必須考慮幾個因素。預估方法時應考慮使用哪種中和緩沖液,以及是否存在任何固體。此外,由于水解速率或程度會因蛋白質所含的氨基酸而異,因此需要對水解過程進行時程研究,并適當?shù)仳炞C整體方法。在水解過程中正確處理樣品有助于獲得高質量的結果。這類分析中最常見的問題通常源于選用的技術不適合,或者技術本身性能不達標。要使用這種方法進行有效的水解,首先必須回答四個問題:

  1. 樣品是否需要稀釋?

  2. 水解管中應分配多少樣品?

  3. 水解管中具體應添加多少體積的酸(僅限液相水解)?

  4. 如果此階段要使用內標,用量是多少?

以下各個小節(jié)概述了必要的測定步驟,并適時提供了示例計算。

2.1.1 基本考慮要點

應保證水解樣品中含有2–25 µg蛋白質(除非樣品量有限),以便盡量減少污染的影響。無論采用哪種水解模式,都建議保證20 µg的蛋白質含量。

2.1.2 液相水解前的樣品稀釋(如果需要)

計算示例:確定稀釋要求

現(xiàn)有溶于150 mM NaCl溶液,濃度為5 mg/mL的蛋白質樣品,需要計算該樣品的固體量(包括鹽)和稀釋因子。

步驟1:確定樣品中的固體總量。

第一步是確定樣品中的固體總量。將蛋白質濃度(µg/µL)乘以鹽的重量濃度(濃度 × 分子量)可得到固體總量。

image.png

步驟2:計算將樣品稀釋至含有20 µg目標質量的稀釋比例。

下一步是確定將樣品稀釋至含有20 µg蛋白質(溶于20 µL溶液中)所需的稀釋比例。將目標量/目標體積乘以樣品濃度的倒數(shù)即可得到稀釋比例。通過計算可知,得到上述樣品所需的稀釋比例為1:5

image.png

2.1.3 分配到水解管中的樣品體積

推薦的水解總體積為100 µL(使用6 × 50 mm水解管時),其中樣品體積在10–20 µL范圍內。樣品體積(無論是否稀釋)取決于水解的類型,應遵循如下指南:

需要再次強調的是,樣品中的蛋白質含量越低,分析就越容易受到污染。

2.1.4 加入水解體系的酸體積

加入水解體系中的酸的體積非常關鍵,對于液相水解來說尤其如此。確定酸體積的指南如下(附帶一個示例)。

計算示例:確定加入液相水解體系中的酸體積

按照上述指南,加入水解體系的最小酸量相較于緩沖液濃度須過量25倍,相較于樣品重量須過量100倍。因此,要確定所需的酸體積,必須計算以下內容:

  1. 現(xiàn)有緩沖液的量

  2. 中和(25倍)樣品中的緩沖液所需的酸量

  3. 將酸的量換算為體積

  4. 樣品中的固體總量

  5. 相較于樣品量過量100倍所需的最小酸量

  6. 將酸的量換算為體積

  7. 所需的總酸量(中和所需的酸量與過量酸量之和)

對于濃度為2.1 mg/mL,溶于2 mM Na/K2PO4的蛋白質樣品:

步驟1:確定每管中緩沖液的量。

將緩沖液的摩爾濃度乘以可滴定組的數(shù)量(三組磷酸鹽緩沖液),然后將體積調整為分配樣品的總體積(在本例中為10 µL),可得到每個管中緩沖液的量。

image.png

每管含60 nmol緩沖液。

步驟2:確定相較于緩沖液過量25倍的酸量。

接下來,將每管中的緩沖液量乘以25,得到過量25倍的酸量。

image.png

這是能夠有效中和緩沖液的酸的摩爾量。

步驟3:確定中和每個管中的樣品緩沖液所需的6 N鹽酸體積(將摩爾量換算為體積)。

接下來,必須將中和緩沖液所需的酸的摩爾量換算為加入管中的酸的體積。

image.png

對于該樣品,0.25 µL 6 N鹽酸可有效中和緩沖液。

步驟4:確定每管中的固體總量(蛋白質 + 緩沖鹽)。

要計算相較于樣品量過量100倍的酸量,必須先確定樣品中的固體總量。固體總量是蛋白質、緩沖鹽以及所有其他固體物質的總和。本例中的樣品是純化后的蛋白質。

將蛋白質濃度(µg/µL)乘以鹽的重量濃度(濃度 × 分子量)可以得到固體總量。

image.png

計算得出該樣品的固體總量為24.9 µg。

步驟5:計算每管中相較于樣品量過量100倍的鹽酸總量。

為確定過量100倍的目標酸量,將固體總量乘以100

image.png

步驟6:將每管中過量酸的質量換算為6 N鹽酸的體積。

最后,將酸的質量除以酸的摩爾質量,再除以酸的體積摩爾濃度,可以將過量酸的質量換算為需要向每管中添加的6 M鹽酸的體積。

image.png

在本例中,相較于樣品量過量100倍所需的6 M鹽酸體積為11.4 µL。

步驟7:加入每管中的6 N鹽酸的最終體積(步驟3 + 步驟6)。

添加到每管中的酸的最終體積是中和樣品緩沖液的酸體積與相較于樣品量過量100倍的酸體積之和:

image.png

確保有效水解所需的6 M鹽酸的體積為11.65 µL。該體積可四舍五入為方便精確移液的體積。

2.1.5 內標(IS)

使用內標(IS)可很好地補償樣品中各氨基酸可能發(fā)生的水解。正纈氨酸(Nva)是最常用的內標。

使用內標時請注意:

要確定起始樣品中所需的內標量,請從最終樣品中的內標量進行反向計算。衍生化步驟很重要,應視作計算的一部分。

計算示例:確定樣品中內標的量

步驟1:確定每管的內標總量。

通過反向計算來確定內標總量:用最終樣品中所需的內標量乘以衍生化樣品的稀釋因子和水解管中的復溶樣品的稀釋因子。在本例中,最終衍生化樣品中需要25 pmol內標,在衍生化過程中,樣品被稀釋了10倍,在衍生化之前,樣品被稀釋了5倍。因此:

image.png

計算表明水解樣品中需要1250 pmol內標。

步驟2:將內標摩爾濃度換算為質量。

使用MW (mg/mol)進行計算并將體積由μL換算為mL,我們可以計算得出,每mL起始樣品中需要加入0.14 mg內標。

image.png

2.1.6 氣相酸水解

氣相水解推薦用于幾乎或完全不含顆粒物、相對純凈的蛋白質或肽樣品。氣相水解被視為靈敏度非常高的方法。這種水解方法是獨立、自動化的水解工作站的首選方法。水解過程中的真空控制、溫度維持、氮氣吹掃和樣品干燥等操作最好由自動化系統(tǒng)來執(zhí)行,如第4節(jié)所述的Eldex水解工作站。

試劑:

注:有關試劑的詳細信息,請查閱水解工作站的操作手冊。

流程(使用自動化工作站):

  1. 6 x 50 mm水解管中干燥含有0.5–20 µg蛋白質的樣品。

  2. 向真空瓶底部加入含0.5%苯酚的200 µL恒沸鹽酸(參見下文提示")。

  3. 交替執(zhí)行三個真空-氮氣吹掃循環(huán)后,在真空條件下密封真空瓶。

  4. 112–116 °C下水解24 h。

  5. 冷卻真空瓶;用實驗室紙巾擦拭水解管外多余的鹽酸;在真空下干燥。

提示:

注:水解后,鹽酸通常會變成棕色。棕色來自苯酚。乙醇或丙酮能很好地去除真空瓶內部和頂部的變色。

注意:水解問題和衍生化問題可能難以區(qū)分。

2.1.7 液相酸水解

樣品比較復雜時,通常采用液相水解法。這種情況下,存在可能干擾氣相水解的顆?;蚱渌愇?。此方法的總體靈敏度較低,但如果謹慎精準地執(zhí)行,也能得到良好的結果。

流程:

開始前 -

稱取相當于約20 mg蛋白質的樣品(精確至0.1 mg)至水解管中,或將稀釋后的樣品轉移至水解管中(參見第2.1.3節(jié)和第2.1.4節(jié)的計算結果)??傮w積通常為10 µL。混合。

  1. 向水解管中精確加入第2.1.5節(jié)計算出的內標體積?;旌?。

  2. 添加過量的6 N鹽酸(第2.1.4節(jié)步驟3計算出的體積),混合后用氮氣吹掃30 s。立即加蓋。

  3. 110 °C恒溫箱中放置24 h。(這些參數(shù)應通過目標蛋白質和氨基酸的時程研究確定。)

  4. 從恒溫箱中取出水解管并待其冷卻。

  5. 接下來可進入樣品衍生化步驟。

2.1.8 酸水解的故障排除

某些氨基酸可能會受到水解不當?shù)挠绊憽@纾?/span>

2.2 色氨酸(Trp)分析

Trp在常用的6 N鹽酸水解條件下不穩(wěn)定,因此蛋白質和肽中Trp的分析較為復雜??梢允褂萌缦碌奶娲夥椒ㄉ赏暾?/span>Trp以供分析:

2.2.1 用于色氨酸分析的甲磺酸(MSA)水解法

MSA試劑必須直接加入6 × 50 mm樣品管(液相水解),因為這種酸不會揮發(fā)。加入甲醇以及水解后的中和步驟可使色氨酸獲得良好的產率,并且不會干擾任何后續(xù)的衍生化過程。圖2MSA與蛋白質的反應圖解。

image.png

2.用于Trp分析的MSA水解法

注:本方法也可用于CysMet的測定。它將Cys轉化為Cya,將Met轉化為蛋氨酸砜。

注:TyrTrp在通常用于CysMet分析的過甲酸氧化法中不穩(wěn)定。

2.2.1.1 設備和試劑

2.2.1.2 流程

  1. 向每個裝有干燥樣品的6 ×      50 mm水解管中加入20 µL0.2%(w/v)色胺鹽酸鹽的4 M MSA。

  2. 向反應瓶中加入100      µL水。

  3. 密封反應瓶以便進行水解。

  4. 110 °C下水解20–24 h

  5. 冷卻后,打開反應瓶,然后向每個水解管中加入22      µL 4 M KOH(足以中和管中的酸)。

  6. 在真空下干燥。

  7. 接下來即可對樣品進行衍生化。

提示:

應使用對照空白樣品檢查是否存在干擾。

注意:

2.2.2 用于色氨酸分析的堿水解法

如果色氨酸的酸水解會引起穩(wěn)定性問題,可使用蛋白質堿水解法作為替代方法。

2.2.2.1 設備和試劑

2.2.2.2 堿水解法流程

  1. 堿水解可能需要使用塑料(例如Teflon)管,防止硅酸鹽的形成以及后續(xù)的溶解問題或衍生化問題。

  2. 按照上述MSA水解流程,直接向水解管中加入20 µL新鮮的4 M NaOH。

  3. 密封水解管,在112      °C下加熱16 h。

  4. 冷卻后用過量乙酸中和。

  5. 接下來即可對樣品進行衍生化。

  6. 運行空白樣品,確定污染水平。

  7. 使用標準品和已知樣品驗證方法。

2.3. 用于分析含硫氨基酸(半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸)的水解方法

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3.含硫氨基酸

蛋白質樣品中的半胱氨酸(Cys)在標準酸水解條件下不穩(wěn)定,因此半胱氨酸的定量較為復雜。遺憾的是,與Trp水解不同,半胱氨酸的替代酸水解或堿水解法效果并不理想。Cys分析的兩種常見的方法都需要將半胱氨酸轉化為更穩(wěn)定的衍生物。第一步是巰基的烷基化,第二步是將其氧化成酸穩(wěn)定的磺酸、磺基丙氨酸或三聚氰酸(Cya)。

警告:Cys分析的另一個復雜之處在于,大部分氨基酸以半胱氨酸二聚體 - 胱氨酸(Cys2)的形式存在,在進行任何烷基化處理之前,必須先將其還原為半胱氨酸。

需要注意的是,這個特殊處理過程應在標準酸水解步驟之前執(zhí)行。

2.3.1 使用過甲酸氧化法對半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸進行脫酰胺化處理

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4.使用過甲酸將胱氨酸和半胱氨酸氧化為磺基丙氨酸

過甲酸是一種強氧化劑,可以定量地將半胱氨酸(Cys)和胱氨酸(Cys2)轉化為磺基丙氨酸(Cya)(圖4)。文獻報道了該試劑的許多應用,涉及各種條件和方法。下面的方法來源于Tarr, G.E. 1986年的方法。

注:使用此方法分析半胱氨酸和蛋氨酸可以得到更準確的結果。

2.3.1.1 設備和試劑

2.3.1.2 流程

  1. 6 × 50 mm水解管中真空干燥樣品(0.1–10 µg蛋白質或50–2000 pmol肽)。

  2. 97%甲酸與過氧化氫按體積比19:1混合,蓋上蓋子在22 °C下放置1 h

  3. 在干燥樣品中加入10      µL上述試劑,在22 °C下放置30 min后進行真空干燥。

  4. 按照標準的6 M鹽酸水解流程進行水解(參見第1.1節(jié))。

注:TyrTrp在此氧化過程中不穩(wěn)定。

2.3.2 胱氨酸烷基化

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5.胱氨酸和半胱氨酸的烷基化

烷基化法相較于過甲酸氧化法選擇性更高,而且對其他氨基酸幾乎或完全沒有影響。因此,烷基化法更適用于完整蛋白質分析,以及Cys修飾后的其他分析(例如肽圖分析)。

此方法使用4-乙烯基吡啶進行烷基化反應;下面概述的通用流程也適用于其他幾種烷基化試劑。原則上,必須在樣品中加入足量的還原劑將胱氨酸(Cys2)轉化為半胱氨酸(Cys)。接下來,在還原的樣品中添加過量烷基化試劑(圖5)。

2.3.2.1 設備和試劑

2.3.2.2 試劑制備:0.5 M,pH 8.3

  1. 6.4 mL N-乙基嗎啉中加入水,定容至100 mL。

  2. 使用乙酸將pH調節(jié)至8.3。

2.3.2.3 流程

以下流程可用于分析1–1000 nmol蛋白質或肽。

  1. 將樣品放入可密封的小瓶中;進行真空干燥、N2干燥或凍干處理。

  2. 將樣品溶于1 mL緩沖液中。

  3. 加入1 g鹽酸胍。混合。

  4. 加入4 mg      DDT。混合。

  5. 樣品覆蓋氮氣層后密封緊實,然后在室溫下溫育4 h。

  6. 加入8 µL      4-VP,覆蓋氮氣層,密封,然后在室溫下溫育4–16 h

  7. 加入3 mL水。

  8. 對樣品進行脫鹽。

  9. 制備好的樣品接下來可以進行酸水解。

注:通過將緩沖液減少至0.25 mL、鹽酸胍減少至250 mg、DTT減少至1 mg4-VP減少至2 µL,可減小總反應體積。減小后的總體積足夠用于最多250 pmol樣品的水解。樣品烷基化后,用750 µL水稀釋樣品并繼續(xù)下一步操作。

2.3.2.4 用于后續(xù)衍生化的校準標準品(可選)

  1. 制備2.5      mM吡啶乙基半胱氨酸(PEC)溶液。

  2. 200 µL PEC溶液中加入200 µL氨基酸標準樣。

  3. 10 µL混合好的PEC校準混合物進行衍生化反應。

  4. 將混合物復溶至100      µL;進樣4 µL,在250 pmol水平進行校準。

注:8 µL 4-VP含量約為74 µmol。在烷基化過程中,可以使用相同濃度的其他烷基化試劑(例如碘乙酸)替代4-VP。


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